Quattro anni intensi di ricerche ed esperimenti, tredici mesi di revisione, 60 pagine di risposte ai 4 revisori con competenze eterogenee nominati dalla prestigiosa rivista scientifica Nature. Questi i numeri che hanno portato alla recente pubblicazione dei risultati della ricerca del team di Alberto Bardelli, genetista molecolare e direttore del Laboratorio di Oncologia Molecolare dell'IRCCS di Candiolo (TO) e docente del Dipartimento di Oncologia dell’ Università di Torino, i due istituti presso i quali la ricerca si è concretizzata grazie ai fondi di AIRC ed Unione Europea.

Una nuova via per l'immunoterapia

Lo studio apre una nuova strada nel campo dell’immunoterapia ponendosi l’obiettivo di rendere le cellule tumorali visibili al sistema immunitario, in modo che quest’ultimo possa sferrare il suo attacco e bloccare lo sviluppo del tumore. Molti tipi di cellule neoplastiche riescono infatti ad eludere i meccanismi di difesa naturali dell’organismo umano mascherandosi ed impedendo il riconoscimento da parte del sistema immunitario o bloccandone l’attacco mediante l’interazione con i ligandi degli immuno checkpoint a livello delle cellule T. In questo modo il tumore protegge se stesso e ha la possibilità di diffondersi indisturbato. Ma com’è possibile “etichettare” le cellule tumorali per fare in modo che il sistema immunitario le attacchi? I ricercatori torinesi hanno preso in considerazione un aspetto peculiare riscontrato in diversi tipi di tumore: l’insorgenza di nuove mutazioni dette “neoantigeni”.

"Etichettare" le cellule tumorali con i neoantigeni

Le alterazioni molecolari nei geni coinvolti nella riparazione degli errori di trascrizione del DNA (mismatch repair - MMR) promuovono l'insorgenza del cancro e ne favoriscono la progressione; tuttavia i tumori con deficit nel sistema MMR mostrano frequentemente prognosi favorevole e progressione indolente anche se non è del tutto chiaro il meccanismo molecolare che riconduce ad un esito clinico positivo. Inoltre questi stessi tumori con deficit MMR, come ad esempio il tumore del colon-retto, sembrano rispondere meglio all’immunoterapia. Partendo da questi presupposti ed utilizzando un approccio non convenzionale, gli studiosi hanno ipotizzato che l’inattivazione del processo di riparazione del DNA di una cellula inducesse la formazione di nuove mutazioni e che alcune di esse, i neoantigeni per l’appunto, rendessero le cellule cancerose riconoscibili come estranee e quindi attaccabili dal sistema immunitario. Nei loro esperimenti, i ricercatori hanno utilizzato il sistema di editing genomico CRISPR-Cas9 per inattivare l'omologo murino MutL1 (MLH1), che fa parte dei geni MMR, nelle cellule di cancro colorettale, mammario e pancreatico del topo. L'inattivazione del sistema MMR ha aumentato notevolmente il carico mutazionale delle cellule trattate portando a profili mutazionali dinamici, con conseguente continuo rinnovo dei neoantigeni sia in vitro che in vivo; mentre le cellule che conservavano la capacità di riparazione MMR hanno mostrato un carico mutazionale stabile e profili di neoantigeni costanti nel tempo. La sorveglianza immunitaria è migliorata quando le cellule tumorali in cui MLH1 era stato inattivato hanno accumulato neoantigeni per diverse generazioni. Recenti ricerche hanno infatti portato a ipotizzare che sia necessario un elevato carico mutazionale perché l'immunoterapia sia efficace; anche se l'associazione tra il numero di mutazioni e la risposta al blocco del sistema di controllo del sistema immunitario non è assoluta, poiché un'ampia frazione di tumori iper-mutati non risponde ai modulatori del sistema immunologico.

Germano: "Aumentando i neoantigeni il sistema immunitario riconosce e neutralizza il tumore"

Giovanni Germano, primo autore del lavoro, ricercatore e PhD in Immunologia di base ed applicata conseguita presso l’Istituto Clinico Humanitas e l’Ospedale San Raffaele di Milano, formazione che si è rivelata fondamentale per questo lavoro, ci spiega: “Abbiamo dimostrato con i nostri esperimenti che incrementando il carico mutazionale e creando questi non-self antigen a livello tumorale riusciamo a rompere il meccanismo di freno stabilito dal tumore. Aumentando notevolmente la presenza dei neoantigeni infatti il sistema immunitario non può ignorare ciò che sta accadendo e attacca il tumore riuscendo a neutralizzare le cellule neoplastiche”. Questi gli esperimenti di laboratorio eseguiti su linee cellulari appositamente create tramite inattivazione del meccanismo di riparo del DNA.

Ma i ricercatori torinesi non si sono fermati qui e hanno tentato l’inoculo nei topi. “Le cellule con MMR inattivato venivano rigettate una volta inoculate nel topo, perciò sembrava che gli esperimenti in vitro fossero conclusi” ci confida Germano. “Abbiamo però studiato un’ulteriore prova a sostegno della nostra tesi: inoculando le cellule ingegnerizzate in topi immunocompromessi abbiamo osservato la crescita del tumore. Poi abbiamo trapiantato frammenti della massa tumorale comprensiva del microambiente in topi immunocompetenti scoprendo che in questo modo il tumore era in grado di attecchire ed accrescersi. A questo punto abbiamo pensato di fornire inibitori degli immuno checkpoint utilizzando una schedule non convenzionale cioè non dopo 3 giorni dall’inoculo come accade abitualmente, ma attendendo un tempo maggiore proprio per consentire la crescita del tumore nel nuovo organismo e lasciando che raggiungesse dimensioni considerevoli, pur rimanendo nei limiti etici. Sorprendentemente in questo caso abbiamo rilevato una risposta da parte del sistema immunitario”.

Bardelli: "L'idea anticovenzionale di utilizzare le mutazioni contro il cancro"

“L’idea che si possano utilizzare le mutazioni contro il cancro è del tutto anticonvenzionale e va contro ogni logica da libro di testo” ci spiega Bardelli. “Esistono tuttavia pazienti neoplastici con un elevato carico mutazionale che presentano un andamento prognostico favorevole. Ora davanti a noi si aprono 2 strade: innanzitutto vogliamo capire la qualità dei neoantigeni e identificare quali sono le sequenze migliori per generare una risposta immunitaria. Probabilmente più che le mutazioni puntiformi potrebbero giocare un ruolo fondamentale le inserzioni/delezioni (in/del) che modificano il frame di lettura (frameshift). Inoltre è nostra intenzione indagare la funzione di altri geni del MMR oltre a MLH1 perché potrebbero avere effetti ancora più marcati nel risveglio del sistema immunitario”.

E prosegue: “Tradurre questo tipo di approccio tramite terapia genica nel paziente non è al momento attuabile, stiamo però lavorando per realizzare l’editing genomico direttamente in topi anziché inoculare le cellule ingegnerizzate. Parallelamente stiamo sviluppando un approccio di tipo farmacologico cercando innanzitutto di riposizionare farmaci che già esistono. Alcuni chemioterapici, come temozolomide (TMZ) già utilizzato negli esperimenti del recente lavoro, hanno come effetto collaterale l’induzione di mutazioni. L’idea è quella di sfruttarli per ottenere l’accumulo di mutazioni che ci serve. Non è escluso inoltre che si possa sviluppare un farmaco in grado di bloccare l’attività catalitica di MLH1. Abbiamo già coinvolto l’Istituto Nazionale dei Tumori, il Niguarda Cancer Center e l’Università di Milano per verificare le nostre ipotesi per futuri sviluppi clinici”.

Ancora lontane le applicazioni nella terapia genica e farmacologica

“La nostra è una scoperta di base più che traslazionale, rappresenta un concetto importante nella comprensione dei meccanismi tumorali. Siamo ancora in una fase di scoperta, la traduzione in ambito clinico è ancora lontana” afferma Bardelli, neoeletto presidente del EACR (European Association for Cancer Research), la più grossa associazione europea sulla ricerca sul cancro. “La ricerca di base non deve essere fatta in base alle ricadute cliniche, essa può fornirci ancora tante informazioni per meglio comprendere il cancro. Questo lavoro si inserisce in questo ambito, cercheremo poi, se fattibile, di trasformare le informazioni raccolte il più rapidamente possibile in un farmaco.”

“È stato un grosso lavoro di squadra”, commenta Germano, “che non sarebbe stato possibile senza l’attività coordinata di genetisti, esperti di sequenziamento e bioinformatici. Il processo di revisione è stato incredibilmente lungo e le richieste le più disparate. Ci sono stati momenti di scoramento ma non ci siamo mai arresi. Nonostante la competizione fosse alta non abbiamo trascurato nessun aspetto dei nostri risultati e ci siamo fermati a riconsiderarli risolvendo i problemi tecnici prima di proseguire gli esperimenti”.

Sforzi che li hanno condotti al ben meritato successo. Intanto in quel di Torino i ricercatori si godono il momento senza trascurare i nuovi esperimenti. Siamo certi che sentiremo ancora parlare di loro.