E’ stata la Breakthrough 2015 per la rivista Science ma la tecnica di editing genomico chiamata CRISPR si candida a giocare un ruolo da protagonista anche nel 2016.
Di sicuro ne parleranno molto gli scienziati che prenderanno parte all’annuale meeting dell’American Society of Gene and Cell Therapy (ASGCT) che è in corso in questi giorni a Washington. Le questioni sul tavolo sono molte ma la domanda fondamentale, come scrive la rivista Science (http://www.sciencemag.org/news/2016/05/gene-editor-crispr-won-t-fully-fi...), è una sola: CRISPR/Cas è pronta per il proprio debutto? 

CRISPR: editing genomico veloce, poco costoso, estensibile

Per chi si fosse sintonizzato da poco sull’universo CRISPR è doveroso un piccolo riassunto delle puntate precedenti. È una tecnologia nata da appena quattro anni e già diffusa nei laboratori di tutto il mondo. Questa tecnica consente di eseguire più manipolazioni genetiche per volta, lavorando in combinazione con la nucleasi Cas9. 

Il metodo CRISPR/Cas9 permette un editing del DNA veloce, poco costoso e facilmente estensibile a diversi organismi. I risultati in questi anni sono stati molti: la creazione di un gene capace di sradicare una grande varietà di parassiti, la modifica del DNA di un embrione umano (un lavoro controverso compiuto da ricercatori cinese la primavera scorsa) e la inattivazione di 62 copie del DNA di un retrovirus nel genoma di un maiale.

Un crescendo rossiniano di studi e start-up su CRISPR

Un interesse sempre più crescente verso questa tecnica che si evince anche dal numero di paper prodotti ogni anno. All’ASGCT verranno, per esempio, presentati 93 abstract su CRISPR (su un totale di 768), rispetto ai soli 33 dello scorso anno. Un crescendo rossiniano di studi che ha già attirato centinaia di milioni di dollari di investimenti in start-up farmaceutiche. 

Tutto molto bello, direbbe il grande Bruno Pizzul, ma allora perché molti scienziati affermano che CRISPR deve ancora percorrere una strada molto lunga prima di essere utilizzato in modo sicuro ed efficace per la terapia genica?

Strada dura e difficile sicuramente per malattie come la distrofia muscolare o la fibrosi cistica. In questi casi la correzione del gene deve essere fatta direttamente sul paziente e se le cellule prima vengono rimosse, poi riparate, si abbassano le possibilità di avere un numero adeguato di cellule in grado di sopravvivere una volta reimpiantate. E proprio la necessità di trattare le cellule all’interno del corpo è una delle risposte che deve dare, ancora, CRISPR. 

Off-targeting: possibile falla di CRISPR

Una potenziale falla di questa tecnica è data, infatti, dal cosiddetto off-targeting, ovvero la possibilità che la modifica di un gene vada a intaccare, in modo imprevedibile e indesiderato, altre zone del genoma. L’off-targeting potrebbe portare, nel peggiore dei casi, ad alterare i cosiddetti geni oncosoppressori, quelli che proteggono l’organismo dallo sviluppo di tumori bloccando la riproduzione incontrollata delle cellule. Se la CRISPR/Cas9 disattivasse erroneamente uno di questi geni, per effetto dell’off-targeting, potrebbe aumentare la probabilità di sviluppare un tumore. Su questo aspetto il gruppo di J. Keith Joung al Massachusetts General Hospital, come racconta la rivista Nature, è riuscito a portare gli effetti off-targeting a livelli tali da renderli non più rintracciabili, persino con i metodi più precisi. 

I problemi della ricombinazione omologa (HDR)

Altro problema è il processo di ricombinazione omologa (HDR). CRISPR lavora accoppiato ai sistemi di riparazione del DNA presenti nella cellula, che, dopo il taglio da parte di Cas, operano una ricucitura secondo diversi meccanismi. Alcuni di questi meccanismi sono per natura imprecisi e introducono “errori” nella sequenza, cosicché a volte il gene modificato diventa non più funzionale. Questa modalità può essere sfruttata per eliminare l’espressione di un gene di cui si vuole studiare la funzione. Un altro meccanismo di riparazione, chiamato “ricombinazione omologa”, agisce con precisione, permettendo di riparare il taglio e di inserire sequenze desiderate. Grazie a questa strategia, è possibile non solo studiare l’effetto dell’introduzione di determinate mutazioni ma anche correggere le mutazioni che causano malattie genetiche. Per capire meglio prendiamo, ad esempio, una cellula affetta da fibrosi cistica. Possiamo inserire una sequenza guida corrispondente al gene mutato (CFTR). Facendo esprimere la proteina Cas, questa andrà a tagliare la sequenza di CFTR mutato. Se aggiungiamo anche la sequenza di CFTR corretta all’equazione, tramite ricombinazione omologa, avremo la correzione del difetto genetico direttamente nel genoma. Dove sta il problema? Il sistema di riparazione omologa è attivo solo nelle cellule in divisione, questo renderebbe inutilizzabile il sistema CRISPR per la maggior parte delle cellule del corpo come quelle del fegato, i neuroni, le cellule staminali del sangue.
Alcuni ricercatori stanno però già provando ad aggirare l’ostacolo attraverso dei farmaci in grado di accendere il sistema HDR in queste cellule.

L’enzima Cpf1, alternativa a Cas9

Una delle componenti fondamentali nella tecnica CRISPR sta nella scelta del vettore virale. Spesso i ricercatori sono costretti a usare due virus differenti per portare i componenti di CRISPR all’interno della cellula, in questo caso la tecnica risulta meno performante. Un’alternativa,  sviluppata nei laboratori della Harvard University diretti da Feng Zhang, potrebbe essere l’utilizzo di CRISPR/Cpf1, un'evoluzione del metodo CRISPR/Cas9. L’enzima Cpf1 è, infatti, molto più semplice rispetto allo standard Cas9 ed essendo di dimensioni più piccole potrebbe essere più facile da ingegnerizzare nei vettori virali. 

I lavori di Zhang offrono un’ulteriore risposta a un’altra domanda che pongono gli scettici di CRISPR: quanto tempo rimane attivo Cas9 all’interno della cellula dopo aver fatto i tagli desiderati?  Zhang ha creato un topo knock-in con il gene Cas-9 sempre acceso. Anche dopo 20 generazioni i topi godevano ancora di buona salute e questo risultato può tracciare anche una nuova strada che sta nel pensare a metodi che non prevedano vettori virali ma nanoparticelle o lipidi in grado di trasportare Cas-9 aldilà della membrana cellulare.  

Troppo presto per il debutto di CRISPR?

Ma torniamo alla domanda iniziale: CRISPR/Cas è pronta per il proprio debutto? Forse, ancora no, ma le prospettive sono ottime anche perché ogni giorno ricercatori nel mondo aggiungono un ingranaggio a questa macchina, come dimostra uno studio appena pubblicato su Nature (http://nature.com/articles/doi:10.1038/nature17946). In questo caso i ricercatori di Harvard hanno perfezionato la “macchina” riuscendo a far lavorare CRISPR-Cas9 sulle singole basi azotate ed evitando di aggiungere o togliere altre “lettere” del codice genetico. Questo miglioramento potrebbe essere applicato a molte malattie genetiche che derivano da mutazioni di una singola base azotata, per le quali il tasso di  successo di CRISPR-Cas9 crollava drammaticamente al 5%.

Arrivederci CRISPR, ci rivedremo presto!